Rivista di formazione e aggiornamento di pediatri e medici operanti sul territorio e in ospedale. Fondata nel 1982, in collaborazione con l'Associazione Culturale Pediatri.
Maggio 1999 - Volume II - numero 5
M&B Pagine Elettroniche
Contributi Originali - Ricerca
Un
test immunoenzimatico rapido e semplice per ricercare gli anticorpi
anti-transglutaminasi umana nella malattia celiaca
Clinica
Pediatrica,IRCCS Burlo Garofolo, Trieste
°Scuola
Internazionale di Studi Avanzati (SISSA), Trieste
*Pediatric
Department, University of Maryland, Baltimora, USA
°°Dipartimento
di Biologia, Università di Trieste
A
simple and quick immuno-enzymatic test to search for human
anti-transglutaminase antibodies in celiac disease
Aim of
the Work
The
antigen that is recognised by anti-endomysium IgA antibodies (EMA)
has been recently identified in human tissue transglutaminase
(hr-tTG). Many immunologic tests have been developed in order to
search for anti-transglutaminase antibodies: they include both
radioimmunologic tests and ELISA techniques. However, they require a
specialised laboratory and at least 2 weeks before the family
paediatrician can obtain their results.
We
developed and assessed a quick immuno-enzymatic test (DIA) to search
for anti-hr-tTG antibodies - both IgA and IgG - in serum and whole
blood.
Methods
Our group
cloned, expressed and purified hr-tTG starting from intestinal
biopsies of celiac subjects. DIA is based upon the absorption of
hr-tTG as a spot (0.1 g/spot) on Immobilion-P sheets, which are then
treated to block the antigen on their surfaces. These sheets are
incubated for 5 minutes with human anti IgA and IgG antibodies
conjugated with alkaline phosphatase. After a short washing up, they
are incubated with a solution which contains the substrate, then
dried and examined; the results are given by colorimetric reaction.
Twenty
celiac patients in a florid phase (2 of them with IgA deficit) were
assessed with DIA and with ELISA in order to search for anti hr-tTG
antibodies (both IgA and IgG).
Results
All
florid celiac patients, including the 2 patients with IgA deficit,
were positive both for ELISA and for DIA. The group of 45 healthy
controls showed a false positive with DIA and no positive with ELISA.
Conclusions
In terms
of effectiveness, the DIA test and the ELISA method are equivalent.
DIA is simple and could be used as a first non-invasive screening on
a blood drop by family paediatricians.
Articolo
Introduzione
e scopo del lavoro
La
malattia celiaca è usualmente sottodiagnosticata. E' legata
alla presenza degli alleli HLA DQA1*0501/DQB1*0201. La malattia è
legata alla produzione di un auto antigene, indotta nei soggetti
predisposti alla assunzione di glutine. Questo autoanticorpo, un
tempo identificato come anticorpo antiendomisio (EMA o AEA) è
in realtà la transglutaminasi tissutale tTG.
L'utilizzo
degli anticorpi antitransglutaminasi di cavia (GP-tTG) è
insufficientemente specifico.
Il nostro
gruppo ha messo a punto un test ELISA più specifico contro la
transglutaminasi umana (h-tTG) ricombinanate hr-tTG, amplificato a
partire dalla biopsia intestinale di un paziente con celiachia,
usando un primer specifico e clonando il cDNA con un vettore di
espressione nei batteri.
Il test è
risultato più sensibile e più specifico rispetto a
quello con GP-tTG e a quello con AEA, fornendo una spiegazione per i
rari casi di celiachia AEA negativi.
Esso però
richiede, come gli altri test ELISA, un laboratorio specializzato e
dei tempi di diagnostica non brevissimi. Abbiamo sviluppato e
valutato un test immunoenzimatico rapido (DIA)b per ricercare gli
anticorpi anti-hr-tTG sia IgA che IgG nel siero e nel sangue intero.
In quest'ultima forma esso potrebbe essere usato come primo screening
non invasivo nell'ambulatorio del pediatra di famiglia
Materiali
e metodi
Il DIA è
basato sull'assorbimento dell'hr-tTg, in forma di spot (0.1g/spot) su
dei fogli di Immobilion-P che poi vengono trattati per bloccare
l'antigene sulla loro superficie.
I fogli
vengono incubati per 5 minuti a temperatura ambiente con i campioni
di sangue o siero del paziente e per 5 minuti con anticorpi anti-IgA
e anti IgG umane coniugati con fosfatasi alcalina. Dopo un breve
lavaggio i fogli vengono incubati con la soluzione contenete il
substrato, vengono asciugati ed esaminati per valutarne i risultati,
espressi da una reazione colorimetrica.
Venti
pazienti celiaci in fase florida (tra cui 2 soggetti con deficit di
DGA) e 45 soggetti sani) sono stati esaminati sia con il test DIA,
sia con la metodica ELISA, ricercando gli anticorpi anti-hr-tTG, sia
IgA che IgG.
Risultati
Tutti i
pazienti celiaci floridi, compresi i 2 con deficit IgA, sono stati
riconosciuticome positivi sia dalla metodica ELISA che dal test DIA.
Nel gruppo dei 45 controlli sani si è avuto un falso positivo
colò test DIA e nessuno col test ELISA
Conclusioni
Il test
DIA ha un'efficacia equivalente al test ELISA. E' una metodica
semplice e potrebbe essere usato come primo screening non invasivo,
su goccia di sangue, ad opera dei pediatri di famiglia
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