Rivista di formazione e aggiornamento di pediatri e medici operanti sul territorio e in ospedale. Fondata nel 1982, in collaborazione con l'Associazione Culturale Pediatri.
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Appunti di Terapia
Vettori
virali per il trasferimento di geni
Indirizzo
per corrispondenza:bartolozzi@unifi.it
La
scoperta dell'origine genetica di molte malattie dell'uomo ha creato
le basi culturali per la terapia genica. Le alterazioni dei geni che
sono alla base di queste malattie possono essere diverse:
-
delezione, il gene cioè può mancare completamente
-
mutazione puntiforme: sostituzione di un nucleotide con un altro
nello stesso gene, per cui viene sintetizzato un aminoacido diverso,
in un punto essenziale per il funzionamento della proteina. Di
conseguenza l'enzima (se la proteina codificata è un enzima)
può avere una funzione residua più o meno importante o
può non fornire alcuna attività.
-
traslocazione: dovuta a crossing over ineguale, con migrazione di
nucleotidi da un gene all'altro
- perdita
di un allele
- altro
E' stata
tentata la sostituzione del gene patologico con un gene funzionante
per una completa restitutio ad integrum della funzione (terapia
genica). Si sono quindi succeduti studi per la terapia genica della
deficienza di adenosin deaminasi (ADA), della fibrosi cistica, della
deficienza di recettori delle lipoproteine a bassa densità,
dell'emofilia A e B, della deficienza di alfa-1-antitripsina e della
malattia di Guacher (Walther W, Stein U, Drugs 60, 249-71,
2000).
Per il
trasferimento dei rispettivi geni alla cellula bersaglio o al tessuto
sono stati usati, come vettori, alcuni virus, approfittando della
loro grande capacità di trasportare le informazioni, inserite
nel loro genoma, geneticamente modificato. La scelta dei virus più
adatti al trasferimento dei geni è stata difficile e molto
complessa, perché dovevano essere ridotti al minimo i
potenziali effetti patogeni dei virus, l'immunogenicità e il
rischio potenziale di ricombinazioni omologhe e di tossicità.
Numerosi
vettori virali sono stati studiati in vitro, ex vivo ein vivo, ricavati soprattutto da virus del topo e di virus a
RNA e a DNA dell'uomo. I vettori più comunemente usati sono
stati ricavati dai:
-
retrovirus
-
lentivitus
-
adenovirus
- herpes
simplex virus
-
adenovirus.
Di
recente sono stati studiati sotto questo punto di vista altri vettori
virali, quali il virus del vaiolo, il citomegalovirus, il virus di
Epstein Barr e altri.
Fra tutti
questi, i vettori retrovirali hanno rappresentato il sistema più
importante, poiché essi hanno un'alta efficienza nel
trasferimento di geni e mediano alte espressioni di geni terapeutici.
Ma anche adenovirus o herpes virus hanno caratteristiche tali da
essere utilizzati per il trasferimento di geni.
Con i
retrovirus sono stati compiuti oltre 150 studi, nei quali sono stati
coinvolti 1-500 pazienti. Sebbene la terapia genica con retrovirus
sia stata impiegata essenzialmente nel trattamento dei tumori
maligni, sono state studiate anche numerose malattie ereditarie. In
particolare i vettori retrovirali sono stati usati per la terapia
genica della deficienza di adenosina deaminasi (ADA). Questa
malattia, come si sa, determina una grave immuno-deficienza combinata
(SCID). La funzione delle cellule T è stata parzialmente
restituita dal trasferimento ex vivo del gene ADA e dalla
reintroduzione di queste cellule nel paziente. Questa metodica si è
dimostrata utile e le cellule T di questi pazienti hanno guadagnato
una normale funzione immune. Più recentemente sono state usate
cellule del cordone ombelicale per il trasferimento del gene ADA:
dopo due anni dal trapianto furono ancora dimostrabili cellule
ADA-positive. Tuttavia al momento attuale non è stato ancora
visto un significativo miglioramento nella funzione immune di questi
pazienti.
Tabella -
Aspetti dei sistemi vettori virali per la loro applicazione nella
terapia genica
Vettore
virale | Vantaggi | Svantaggi |
Retrovirus | Capacità
d'inserimento del gene, integrazione stabile nel DNA
dell'ospite, elevati titoli di virus ricombinante, ampio
tropismo d'infettività, relativa facilità di
manipolazione del genoma virale | Difficoltà
nel controllare l'infezione virale, mancata infezione delle
cellule non in divisione, integrazione a caso nel genoma
dell'ospite |
Lentivirus | Infezione
delle cellule in divisione o meno, espressione stabile del gene,
elevata capacità d'inserimento | Mutagenesi
potenziale presenza di sequenze proteiche regolatrici e
accessorie |
Adenovirus | Elevati
titoli di virus, alta espressione genica, grande capacità
d'inserimento, infezione di cellule in divisione e non in
divisione | Risposte
immuni alle proteine virali, nessuna integrazione nel genoma
dell'ospite, espressione genica transitoria |
Virus
adeno-associati | Infettano
le cellule in divisione o meno, ampio tropismo cellulare,
potenziale d'integrazione, bassa immunogenicità e non
patogenicità | Limitate
capacità per i transgeni, difficile generazione di alti
titoli virali, presenza di adenoviruds o herpevirus per la
moltiplicazione dei virus adeno-associati |
Herpesvirus | Infettano
un'ampia varietà di tipi cellulari, alta capacità
d'inserzione, tropismo naturale per le cellule neuronali,
seguita dalla produzione di alti titoli virali | Possibile
tossicità, rischio di ricombinazione, nessuna integrazione
virale nel DNA dell'ospite |
Poxvirus | Alta
capacità d'inserzione, possibile inserzione di grandi
framenti di DNA, alti livelli di di espressione transgenica,,
seguita da virus vivo ricombinante | Possibile
effetto citopatico |
Virus
di Epstein-Barr | Infetta
cellule in divisione o meno con prevalenza per i linfociti B,
alta capacità d'inserimento | Difficoltà
di controllare le linee cellulari |
Poiché
i vettori adenovirus sono molto efficienti nel trasferimento di geni,
essi sono stati spesso usati negli studi clinici di terapia genica.
Il primo uso clinico che ha impiegato gli adenovirus come vettori è
stato quello riguardante il trattamento della Fibrosi cistica, una
malattia gravissima, dovuta ad alterazione del trasporto di cloro
attraverso la membrana cellulare. Poiché si sapeva che gli
adenovirus hanno un particolare tropismo per il tessuto epiteliale,
si è pensato che questi virus rappresentassero il sistema di
scelta per il trasferimento del gene della CFTR. A tale scopo
il gene CFTR venne trasferito all'epitelio nasale, usando i
vettori Ad2 e Ad5, che hanno portato a una transitoria ricostruzione
del trasporto di cloruri nella sede di applicazione.
Queste
prove cliniche hanno indicato che l'applicazione topica del vettore
adenovirus all'epitelio nasale comporta solo un trasferimento di geni
di bassa attività con pochi effetti correttivi a livello
molecolare e funzionale.
In un
altro studio clinico l'epitelio nasale e bronchiale venne in contatto
per via aerosolica con il vettore adenovirale, portando a una
transitoria espressione del gene CFTR in questi tessuti.
Hanno
seguito almeno altri 10 studi in USA e in Europa, che hanno portato
alla conclusione che l'espressione del gene è solo transitoria
e di poca efficacia clinica. Fra le ragioni dell'insuccesso sono
state annoverate diverse possibilità:
- la
barriera mucosa delle cellule bersaglio
- il
relativamente rapido turnover delle cellule delle vie aeree
- la
risposta immune alle cellule infettate
- altre
possibilità
Per il
grande interesse nel mondo per la terapia genica, numerosi sono ancor
oggi gli sforzi per raggiungere un ottimale trasferimento dei geni in
vivo. Per i loro innumerevoli vantaggi i vettori virali sono ancora
al centro dei programmi mondiali di ricerca.
Numerosi
miglioramenti sono stati fatti nel trasferimento dei geni nell'uomo.
Le esperienze di base e gli studi clinici in fase I e II indicano che
specifiche malattie richiedono particolari sistemi di vettori virali.
I vettori virali hanno dimostrato di essere sicuri e ben tollerati.
Tuttavia, almeno per ora, la maggioranza delle prove cliniche che
usano i vettori virali per la terapia genica nell'uomo manca di
significativi successi clinici.
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