Maggio 2001 - Volume IV - numero 5
M&B Pagine Elettroniche
Pediatria per l'ospedale
Le
prove di laboratorio per la diagnosi di toxoplasmosi congenita
La
maggior parte dei neonati con toxoplasmosi congenita (TC) è
normale all'esame obiettivo; purtroppo una gran parte dei neonati non
riconosciuti e non trattati sviluppano nelle età successive
alterazioni a carico dell'occhio e del sistema nervoso centrale
(Guerina NG et al, 1994).
Vi sono
alcuni punti chiave per la diagnosi di toxoplasmosi congenita:
1)
identificazione precisa del momento d'inizio dell'infezione nella
donna in stato di gravidanza
2)
determinazione del momento d'inizio dell'infezione nel prodotto del
concepimento
3)
riconoscimento che l'infezione sia avvenuta dopo la nascita
4)
adattamento delle procedure per praticare un screening di massa, con
buon rapporto costo-efficacia, sia nelle donne in stato di gravidanza
che nei neonati.
A questo
proposito va riconosciuto che una gran parte delle prove di
laboratorio, disponibili nei laboratori privati e negli ospedali, è
inaccurata e spesso mal interpretata. Questa affermazione è
particolarmente vera per le prove d'immuno-fluorescenza indiretta per
anticorpi IgG e IgM e per i sistemi immuno-enzimatici (ELISA) che
misurano gli anticorpi IgM specifici: per questo la Food and Drug
Administration ha avvertito gli operatori sanitari USA sulla
possibilità di una cattiva intepretazione della sierologia
IgM, per la quale suggerisce una Tavola d'interpretazione (Vedi
Tavola n.1).
In linea
di massima tutte le infezioni sospette vanno confermate da laboratori
specializzati. Sono in preparazione prove di ultima generazione, che
si basano su antigeni specifici, piuttosto che su toxoplasma interi o
lisati: queste nuove prove potranno migliorare le risposte nel
futuro.
Le
prove sierologiche per la diagnosi di toxoplasmosi
Le prove
sierologiche per la diagnosi di toxoplasmosi sono molto numerose:
alcune di esse hanno un significato simile.
1)Prova del colore di Sabin-Feldman: è una prova
sensibile e specifica. Serve principalmente per valutare gli
anticorpi della classe IgG. I risultati sono espressi in Unità
Internazionali (UI/mL). La prova si basa su standard di riferimento
dell'OMS.
2)Prova degli anticorpi IgG con fluorescenza indiretta
(IgG-IFA): misura gli stessi anticorpi che sono determinati con
la prova precedente, per cui i titoli di regola vanno paralleli.
Questi anticorpi di norma compaiono 1-2 settimane dopo l'infezione,
raggiungono livelli elevati dopo 6-8 settimane (titoli di 1:1.000 o
superiori) e si riducono dopo mesi-un anno. Titoli bassi (1:4-1:64)
persistono in generale per tutta la vita. Il titolo anticorpale non
si correla con la gravità della malattia. Circa la metà
dei kit IFA per il toxoplasma è stata trovata non
standardizzata in modo appropriato, per cui possono essere trovati
numerosi risultati falsamente positivi o falsamente negativi.
3)Prova di agglutinazione (Bio-Merieux): è una prova
disponibile in Europa, preparata con parassiti interi, conservati in
formalina, atti a dimostrare gli anticorpi.Questa prova è
accurata, semplice da eseguire e di poca spesa.
4)Prova degli anticorpi IgM con la fluorescenza indiretta
(IgM-IFA): è una prova utile per la diagnosi d'infezione
acuta da toxoplasma nei bambini più vecchi, perché gli
anticorpi della classe IgM appaiono più precocemente (anche
solo dopo 5 giorni dall'infezione) e scompaiono più presto
degli anticorpi della classe IgG. Nella maggior parte dei casi, gli
anticorpi ritrovati con questa prova aumentano rapidamente (a livelli
da 1:50 a meno di 1:1.000) e cadono a bassi livelli (1:10-1:20) o
scompaiono dopo settimane o mesi. Da tener presente che alcuni
soggetti continuano ad avere risultati positivi a basso titolo, anche
per molti anni. Ma va anche ricordato che la prova IgM-IFA ritrova
gli anticorpi specifici IgM soltanto nel 25% dei lattanti, infettati
congenitamente, alla nascita. Gli anticorpi IgM spesso non sono
presenti anche nei pazienti immuno-deficienti con toxoplasmosi acuta
o nella maggior parte dei pazienti con toxoplasmosi attiva, presente
soltanto nell'occhio. La prova IgM-IFA può dare inoltre
risultati falsamente positivi, in soggetti fattore-reumatoide
positivi.
5)Prova immuno-enzimatica (ELISA) doppio-sandwich (IgM-ELISA): è
più sensibile e specifica della prova IgM-IFA per la
dimostrazione di anticorpi specifici della classe IgM. Nei bambini di
età più avanzata, un livello di 2 o superiore in
anticorpi IgM contro il toxoplasma nel siero, indica che l'infezione
è stata acquisita di recente. L'IgM-ELISA dimostra circa il
75% dei lattanti con infezione congenita. La prova IgM-ELISA evita
sia i risultati falsamente positivi, dovuti alla presenza del fattore
reumatoide, che i risultati falsamente negativi, dovuti agli alti
livelli di anticorpi IgG, di origine materna, trasferiti
passivamente, come avviene nella prova IgM-IFA. I risultati ottenuti
con i kit del commercio vanno interpretati con cautela, perché
le risposte falsamente positive non sono rare. Va fatta molta
attenzione per guardare se il kit è stato standardizzato per
la diagnosi d'infezione, per esempio nel neonato.
6)Prova IgA-ELISA: è più sensibile della prova
IgM-ELISA per la dimostrazione d'infezione congenita del feto e del
neonato, come anche per la dimostrazione d'infezione acuta in alcune
donne in stato di gravidanza.
7)Prova d'immuno-agglutinazione (ISAGA): combina la fissazione
delle IgM del paziente su una superficie solida con l'uso del
toxoplasma fissato con la formalina a particelle di latex, coperte di
anticorpi. Non ci sono risultati falsamente positivi, dovuti al
fattore reumatoide o agli anticorpi antinucleo. Come abbiamo visto
gli anticorpi IgM verso il toxoplasma si dimostrano con la prova
IgM-IFA in un periodo minore di tempo di quanto non sia possibile con
la prova IgM-ELISA. La prova IgM-ISAGA è più sensibile
della prova IgM ELISA e può dimostrare la presenza di
anticorpi specifici IgM, prima e per periodi di tempo più
lunghi della prova IgM ELISA. Al momento la prova IgM ISAGA è
la prova migliore per la diagnosi d'infezione congenita nel neonato.
Sia la prova IgE ELISA, che la prova IgE ISAGA possono essere utili
per la diagnosi di TC infezione acuta da toxoplasma.
8)Prova di agglutinazione differenziale (HS/SC): questa prova
confronta il titolo anticorpale ottenuto con i tachizoiti fissati con
la formalina (antigene HS) con i titoli ottenuti usano i tachizoiti
fissati con acetone o con alcool metilico, per differenziare le
infezioni recenti o lontane nei bambini più grandi e
nell'adulto. Questo metodo può essere particolarmente utile
nel differenziare le infezioni lontane nelle donne in gravidanza,
poiché i livelli di IgM e IgA dimostrabili con ELISA o ISAGA
possono rimanere a livelli elevati per periodi di tempo molto lunghi
(da mesi ad anni negli adulti e nei bambini più grandi).
9)Prova di emagglutinazione indiretta (IHA): questa prova misura
anticorpi diversi contro il toxoplasma da quelli misurati con l'IFA o
con la prova del colore. Essi possono persistere per anni. Va
ricordato tuttavia che la prova IHA non deve essere usata per i
lattanti con sospetta infezione congenita o nello screening nelle
donne in stato di gravidanza, perché essa può essere
negativa per un periodi di tempo troppo lungo, inizialmente durante
l'infezione.
10)Valutazione del livello anticorpale nell'umor acqueo dell'occhio e
nel liquor: livelli relativamente più alti di anticorpi
contro il toxoplasma, in questi liquidi, dimostrano una produzione
locale di questi anticorpi durante la toxoplasmosi attiva dell'occhio
o del sistema nervoso centrale. Il rapporto è calcolato come
segue:
titolo
di anticorpi nei liquido esaminato concentrazione di IgG nel siero
titolo di anticorpi nei liquido esaminato concentrazione di IgG nel siero
C = ----------------------------------------- x -----------------------------------------------
titolo di anticorpi nel siero concentrazione di IgG nel liquido esaminato
Coefficienti
significativi di correlazione sono 8 o più per l'occhio, 4 o
più per il SNC e oltre 1 per i pazienti con malattia del SNC e
AIDS. Se il titolo sierico della prova del colore è di 300
UI/mL o più, molto spesso non è possibile dimostrare la
produzione di anticorpi specifici locali, usando questa formula, sia
con la prova del colore che con la prova IgM-IFA. Anticorpi della
classe IgM possono essere presenti nel liquor.
11)Ricerca degli antigeni del toxoplasma: l'antigene può
essere ritrovato durante l'infezione acuta, ma non nei soggetti non
infetti o in quelli infetti cronicamente. L'antigene si ritrova nel
siero, nel liquido amniotico e nel liquor di pochi bambini con
malattia congenita.
12)Western blot comparativo: del siero di una madre e di
un bambino. L'infezione congenita è sospettata quando il siero
della madre e il siero del bambino contengono anticorpi che
reagiscono con differenti antigeni del toxoplasma.
13)Prova immuno-enzimatica di filtrazione: la prova si esegue
usando membrane micropori, che permettono simultaneamente lo studio
della specificità anticorpale con l'immunoprecipitazione e la
caratterizzazione dell'isotipo anticorpale con l'immunofiltrazione
per mezzo di anticorpi, marcati con enzimi. Questo metodo è
capace d'identificare l'85% dei casi d'infezione congenita nei primi
giorni di vita. E' ancora da sottoporre a valutazione
14)
Polymerase chain reaction (PCR): viene usata amplificando il
DNA del toxoplasma, che può essere identificato usando una
sonda DNA. La dimostrazione di un gene (B1) ripetuto del toxoplasma,
nel liquido amniotico, rappresenta il metodo di scelta per la
diagnosi di TC nel feto. La sensibilità e la specificità
di questa prova nel liquido amniotico, ottenuto alla 18°
settimana o più di gestazione, è di circa il 95%. La
PCR dell'umor vitreo è utile per la diagnosi di toxoplasmosi
oculare
15)Blastogenesi linfocitaria verso gli antigeni del toxoplasma:
questa prova viene usata per la diagnosi di TC, se la diagnosi non è
ancora sicura e le altre prove sono risultate negative. Tuttavia una
prova negativa non esclude la diagnosi, perché molti lattanti
infettati non rispondono agli antigeni del toxoplasma nel periodo
neonatale.
La
diagnosi nella donna in stato di gravidanza
Eccetto
che in rari casi, soltanto le infezioni primitive che avvengono
durante la gestazione, possono portare a infezione fetale. Ma la
diagnosi clinica di T in una donna gravida è complessa, perché
la maggior parte delle donne che hanno una T acquisita sono
asintomatiche, salvo alcune che presentano una linfoadenopatia
cervicale o un quadro clinico mononucleosi-simile: per questa ragione
la ricerca di anticorpi specifici si rende necessaria.
Le
prove sierologiche sono il principale mezzo di diagnosi, ma i loro
risultati vanno, come abbiamo visto, interpretati con cautela.
La
ricerca degli anticorpi IgG non ci permette di differenziare
l'infezione primaria acuta dalle infezioni latenti di lunga durata.
Le prove più usate per la ricerca degli anticorpi IgG sono,
come abbiamo visto, quelle dell'immunofluorescenza indiretta e
dell'ELISA. Una prova positiva per gli anticorpi IgG alla
fluorescenza indiretta o alle prove ELISA è confermata da alti
titoli (1.000 o più) alla prova del colore di Sabin-Feldman.
Essi raggiungono un picco 1-2 mesi dopo l'infezione e restano
positivi indefinitivamente; i pazienti con sieroconversione o con
aumento del titolo di almeno 4 volte debbono essere sottoposti alla
ricerca delle IgM specifiche, presso un laboratorio specializzato,
per confermare l'infezione acuta.
Come
abbiamo visto, molte altre prove sono disponibili per determinare
l'acuzie dell'infezione materna, attraverso la ricerca di anticorpi
anti-toxoplasma delle classi IgM, IgA e IgE. Le prove
immunoenzimatiche sono più sensibili rispetto
all'immunofluorescenza indiretta per la ricerca delle IgM. L'acuzie
dell'infezione può essere determinata anche con le recenti
prove per determinare l'avidità dell'anticorpo. Gli anticorpi
specifici IgM possono essere misurabili entro 2 settimane
dall'infezione, raggiungono il picco entro un mese, si abbassano in
seguito e di solito non sono più dosabili entro 6-9 mesi. In
rari casi le IgM specifiche possono persistere per 2 anni, per cui
questo reperto confonde le differenziazione di base: quella di
distinguere l'infezione acuta da quella passata.
Gli
anticorpi delle classi IgA e IgE si riducono a concentrazioni non
misurabili, molto prima di quanto non avvenga per le IgM: tuttavia le
prove per dimostrarli sono utili per la diagnosi di infezione
congenita e in altri pazienti per i quali siano necessarie
informazioni più precise sulla durata dell'infezione, come
avviene nelle donne in stato di gravidanza.
Se
viene stabilito attraverso gli esami che si tratta di un'infezione
acuta recente, è bene documentare l'infezione usando
l'amplificazione PCR del gene B1 del Toxoplasma gondii in un campione
di liquido amniotico. La PCR sul liquido amniotico ha sostituito le
prove sierologiche o la coltura del sangue fetale, attenuto alla
cordonocentesi.
Se
il feto ha subito dei danni di organo, come conseguenza
dell'infezione embrionale o fetale, sarà possibile
determinarlo con esami seriati all'ecografia, ricercando in
particolar modo l'idrocefalo, le calcificazioni intracraniche o
l'organomegalia.
Nei
casi di infezione fetale, sospetta o provata, un trattamento
anti-toxoplasma della madre può ridurre o prevenire il danno.
Linee
guida per l'interpretazione della sierologica del Toxoplasma gondii
in gravidanza (FDA, 1997) (< introduzione)
IgM-positivo | IgM-equivoco | IgM-negativo | |
IgG
positivo | Possibile
infezione recente.
Inviare
campione al laboratorio di riferimento | Infezione
da più di un anno o IgM falsamente positive.
Ripetere
l'esame e se il risultato è uguale inviare il campione a
un laboratorio di riferimento | Infezione
da più di un anno |
IgG
equivoco | Possibile
infezione acuta. Ripetere e se il risultato è lo stesso o
è IgG positivo, inviare un campione al laboratorio di
riferimento | Risultato
indeterminato. Ripetere la prova | Risultato
indeterminato. Ripetere la prova o ricercare le IgG con altro
tipo di prova |
IgG
negativo | Infezione
acuta o prova falsamente positiva. Ripetere l'esame e se il
risultato è uguale, concludere che la prova IgM è
falsamente positiva | Infezione
acuta o prova falsamente positiva. Ripetere e se il risultato è
lo stesso concludere che non c'è infezione. | Nessuna
prova d'infezione |
La
diagnosi nel neonato
Dopo il
parto esistono numerose modalità per cercare una conferma del
sospetto d'infezione fetale.
Fra
queste in primo luogo l'inoculazione intraperitoneale del tessuto
placentare fresco nel topo di laboratorio per coltivare il T (Kasper
HL, 2001).
Molto
importante è inoltre la valutazione clinica del neonato con
sospetta toxoplasmosi congenita, eventualmente associata a una TC
cranica, a una visita oftalmologica, un emocromo completo, la ricerca
degli enzimi epatici e l'esame del liquido cerebro-spinale. Accanto a
questi esami la ricerca degli anticorpi IgM, IgA e IgE fornisce
ulteriori argomenti alla diagnosi. A questo proposito bisogna
tuttavia ricordare che molti dei lattanti, effettivamente infettati,
mancano degli anticorpi specifici della classe IgM, mentre la maggior
parte di essi ha anticorpi verso l'una o l'altra delle classi di Ig.
Un complesso di prove d'altra parte è in grado di fornire
sufficienti documentazioni per raggiungere la diagnosi. Nei casi
equivoci può essere usata la trasformazione blastica dei
linfociti in risposta agli antigeni di lisati di toxoplasma. Tuttavia
questa prova è negativa in circa la metà dei neonati
infetti, ma diviene positiva in tutti all'età di un anno.
Gli
anticorpi IgG si abbassano durante il trattamento nel primo anno di
vita, ma si assiste a un rimbalzo sierologico in quasi tutti i casi
dopo la sospensione della terapia. Anche questo fenomeno può
risultare utile nella diagnosi dei casi dubbi.
Screening
di massa
In molti
Paesi europei con alta incidenza di TC vengono praticati screening di
massa sia nelle madri che nei lattanti, con dosaggi mensili delle
prove nelle donne in stato di gravidanza: queste prove in serie sono
capaci di stabilire il momento preciso dell'infezione materna, ma
ovviamente richiedono un sistema complesso di raccolta di siero,
stoccaggio, e metodiche di trattamento (Remington JS et al., 2000).
Gli
screening neonatali (Guerina NG et al, 1994, CDC 2000) per la TC
identificano le infezioni subcliniche: un trattamento precoce può
ridurre le più gravi sequele a lungo termine.
Bibliografia
Boyer KM
- Pediatr Infect Dis J 20, 59-60, 2001
CDC -
Preventing congenital toxoplasmosis - MMWR 49, RR 2, pag.57-72, 2000
FDA
Public Health Advisory 1997; http://www.fda.goc/cdrh/toxopla.html
Guerina
NG, Hsu HW, Meissner HC et al - Neonatal serologic screening and
early treatment for congenital Toxoplasma gondii infection. N Engl J
Med 330, 1858-63, 1994
Kasper HL
- Toxoplasmosis, in E. Braunwald et al, Principles of Internal
Medicine, Harrison's 15° ed., McGraw Hill, New York, 2001, pag
1222-7
Remington
JS, McLeod R, Thulliez P, Desmonts G - Toxoplasmosis, in JS
Remongton, JO Klein, Infectious Diseases of the Fetus and Newborn
Infant, 5° ed. WB Saunbders Ed., Filadelkfia, 2000, pag. 205-346
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